微生物限度檢查法通過標準化流程評估非無菌藥品、醫(yī)療器械等樣品中微生物污染程度，核心步驟如下：

一、前期準備與環(huán)境控制

?潔凈環(huán)境?：操作需在B級潔凈背景下的A級單向流潔凈臺（如生物安全柜）中進行，定期驗證環(huán)境懸浮粒子與微生物指標。

?器具滅菌?：培養(yǎng)皿、移液管、濾器等需121℃高壓滅菌15-30分鐘。

?培養(yǎng)基準備?：

計數(shù)培養(yǎng)基（如胰酪大豆胨瓊脂用于需氧菌，沙氏葡萄糖瓊脂用于霉菌/酵母菌）需進行無菌性及促生長能力驗證；

控制菌檢查用培養(yǎng)基（如麥康凱瓊脂）需預確認抑制能力。

二、樣品制備與稀釋

?供試液制備?：

?固體樣品?：取10g樣品，加入90ml稀釋劑（如pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液），均質(zhì)制成1:10混懸液；

?液體樣品?：直接取10ml或稀釋至1:10；

?抑菌性樣品?：添加中和劑（如頭孢類需頭孢菌素酶）或采用薄膜過濾法去除抑菌成分。

?系列稀釋?：根據(jù)預期污染水平，對1:10供試液進行梯度稀釋（1:100、1:1000等）

薄膜過濾法（抑菌性/低微生物樣品）

取供試液通過0.45μm濾膜，用pH7.0緩沖液沖洗濾膜（每膜總量≤1000ml）；

濾膜貼于培養(yǎng)基平板，培養(yǎng)條件同平皿法。

四、控制菌檢查

?大腸埃希菌?：

取供試液接種至含中和劑的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，30-35℃培養(yǎng)18-24小時；

轉(zhuǎn)接麥康凱液體培養(yǎng)基，42-44℃培養(yǎng)24-48小時，可疑菌落進一步驗證。

?沙門菌?（特定制劑）：

取10g樣品加入TSB培養(yǎng)基，接種菌懸液培養(yǎng)后分離鑒定。

五、結(jié)果判定與報告

?計數(shù)結(jié)果?：需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌數(shù)以CFU/g（ml）報告，如口服制劑細菌數(shù)≤1000 CFU/g；

?控制菌?：不得檢出大腸埃希菌等致病菌（如膠囊劑每10g不得檢出沙門菌）；

?陰性對照?：同步操作的滅菌樣品應無菌生長，否則試驗無效。

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關(guān)鍵注意?：

全程嚴格無菌操作，供試液制備至接種需在1小時內(nèi)完成；

抑菌性樣品必須進行方法適用性驗證，回收率應為50%-200%